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摘要：以水牛胎儿为材料．从生殖腺中分离培养出牛原始生殖细胞，并对水牛原始生殖细胞的分离与克
隆的影响因素进行了探讨。结果发现：（１）分离培养出的原生殖细胞（ＰＧＣｓ）呈集落状生长，细胞堆积密集，细
胞之间界限不清，细胞与周围的成纤维细胞界限明显；未分化的细胞表达碱性磷酸酶（ＡＫＰ）以及Ｏｃｔ一４转录
因子；（２）收集妊娠２９～１００ｄ牛胎ＪＬ２８例，从生殖嵴（腺）或类似物中分离克隆水牛ＰＧＣｓ，２３例出现ＰＧＣｓ
细胞集落。其中胎龄小于４５ｄ（＜３．０ｃｍ）和４５～５５ｄ（３．Ｏ～５．０ｃｍ）各７例，全部出现ＰＧＣｓ细胞集落；
５５～７０ｄ（５．ｏ～９．０ｃｍ）９例。有７例出现ＰＧＣｓ细胞集落，大于７０ｄ的５例，有２例出现出现ＰＧＣｓ细胞集
落。结果表明，水牛原生殖细胞具有多能性特性，胎龄小于５５ｄ的水牛胎儿易于分离培养形成ＰＧＣｓ集落。
（ＡｎｉｍａｌＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ５３０００５，Ｃｈｉｎａ）
ｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｂｕｆｆａｌｏＰＧＣｓｗｅｒｅａｌｓｏｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅＰＧＣｓ
ｏｂｖｉｏｕｓｂｏｒｄｅｒ，ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄＡＫＰ，Ｏｃｔ一４．Ａｍｏｎｇ
２３ＰＧＣｓｃｌｏｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍ２８ｎｏｒｍａｌｂｕｆｆａｌｏ
ｆｅｔｕｓｅｓｏｆ２９～１００ｄ，７ｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｆｒｏｍ７ｆｅｔｕｓｅｓｌｅｓｓｔｈａｎ４５ｄ，７ｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｆｒｏｍ７ｆｅｔｕｓｅｓｏｆ４５
～５５ｄ，７ｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｆｒｏｍ９ｆｅｔｕｓｅｓｏｆ５５～７０ｄ。ａｎｄ２ｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｆｒｏｍ５ｆｅｔｕｓｅｓｏｆｍｏｒｅｔｈａｎ７０ｄ．
ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｂｕｆｆａｌｏＰＧＣｓｈａｖｅ
ｆｒｏｍｆｅｔｕｓｅｓｌｅｓｓｔｈａｎ５５ｄａｒｅｍｏｒｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｏｆｏｒｍｃｌｏｎｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｕｆｆａｌｏ；ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌｇｅｒｍｃｅｌｌ；ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
原始生殖细胞（Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌｇｅｒｍｃｅｌｌｓ，ＰＧＣｓ）是一种来自胎儿原始性腺，具有发育全能性（具有
分化发育成三个胚层细胞的潜力）的细胞。ＤｅＦｅｌｉｃｉ等‘１３用ＥＤＴＡ／ｐｅｒｅｏｌｌ法分离得到较多数量的小鼠
ＰＧＣｓ。Ｌｅｉｃｈｔｈａｍｍｅｒ等嘲分离到牛、猪和兔的ＰＯＣｓ。Ｍａｓｓｉｍｏ等Ⅲ用ＴＭ４培养基体外培养小鼠ＰＧＣｓ，
作者简介：李童（１９８２一）．男，山东枣庄人，硕士研究生；Ｅ—ｍａｉｌ：ｖｌｉｔｏｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。
通讯作者：**顺．研究员，博士生导师；Ｅ—ｍａｉｌ：ａｒｄｓｓｈｉ＠ｇｘｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
增刊李童等：水牛原始生殖细胞（ＰＧＣｓ）的分离培养及生物学特性的研究４７
细胞仅存活３ｄ。直到１９９２年Ｍａｔｓｕｉ等［４３以分离附植后小鼠胎儿的原始生殖细胞为材料，培养传代获
得ＥＳ细胞。该细胞排列紧密，ＡＫＰ（碱性磷酸酶）染色和ＳＳＥＡ一１（阶段特异性胚胎表面抗原一１）均
呈阳性，并能形成类胚体，囊胚注射表明其具有参与嵌合体组织形成的能力，从而首次较为全面地证
实了ＰＧＣｓ同样可作为ＥＳ细胞分离克隆的原材料。目前，从ＰＧＣｓ中分离克隆ＥＳ细胞，在小鼠［５’６］、大
鼠‘７｜、猪‘８ｄ０。、人［ｎ．１２３和牛‘１３３上已经取得重要进展，但在水牛方面，国内尚无该方面的报道。
本研究欲通过对水牛ＰＧＣｓ分离和培养的研究，对水牛ＰＧＣｓ生物学特性进行初步鉴定，并探讨胎
龄和培养方法对分离和培养结果的影响，以初步确定水牛胚胎性多能干细胞的生物学特性，确定分离
和培养水牛ＰＧＣｓ的合适的胎龄和培养的基本３ｌ『：＿｛去≯为进一步建立牛ＥＧ细胞系莫定一定的基础。
１．１．１不同胎龄的水牛胎儿由南宁某屠宰场提供。３５ｍｍ平皿（Ｈｙｃｌｏｎｅ）。
１．１．２试剂高糖型ＤＭＥＭ为Ｈｙｃｌｏｎｅ公司生产，Ｉ。ＩＦ、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ为Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司生产，其他试
１．１．３溶液配制ＰＧＣｓ细胞培养基：高糖型ＤＭＥＭ＋０．１ｍｍｏｌ／Ｉ。ｐ一巯基乙醇＋２×１０６ＩＵ／ＬＬＩＦ＋
ｍｇ／ＬｂＦＧＦ＋２０％血清＋６０ｍｇ／Ｉ。青霉素和１００ｍｇ／Ｉ。链霉素＋Ｏ．０５５ｇ／Ｉ．丙酮
１．２．１水牛胎儿的处理将胎牛用７５％的酒精消毒５～１０ｍｉｎ，打开腹腔，取出性腺，ＰＢＳ洗２遍，用
１．２．２ＰＧＣｓ的分离培养将上述弄碎的性腺加入少量ＰＧＣ细胞培养基，然后用１ｍｌ。注射器反复吹
打将细胞分离后转移到３５ｍｍ平皿中；如胎龄较大（体长≥１２ｃｍ），则反复吹打后在显微镜下用吸管
将分散的小组织块挑出来转移到３５ｍｍ平皿中。最终加培养液１．５ｍＩ。，置于３７Ｃ、５％ＣＯ。的培养箱
１．２．３ 细胞碱性磷酸酶组化染色（ＡＫＰ） 在接种ＰＧＣｓ细胞的培养皿，用ＰＢＳ洗涤３次，然后以４％
多聚甲醛固定３０ｒａｉｎ，再用ＰＢＳ洗涤３次，每次５ｍｉｎ，然后以添加硝基四氮唑蓝，室温下避光显色
１～３ｈ；显微镜观察显色程度适当则用蒸馏水冲洗，终止反应，然后显微镜下观察。
１．２．４免疫荧光检钡 ＩＰＧＣｓａｅＯｃｔ一４的表达所有一抗和二抗都用含１％ＢＳＡ的ＰＢＳ按一定比例稀释。
用４％（ｗ／ｖ）多聚甲醛在室温下固定２０ｍｉｎ，其后，用甲醇在一２０‘Ｃ固定５ｍｉｎ。ＰＢＳ洗涤２次后，滴
加０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００处理２０ｍｉｎ。ＰＢＳ洗涤２次后，滴加１０Ａ ＢＳＡ覆盖ＥＧ细胞，处理３０ｒａｉｎ以封阻
非特异性染色。然后用ＰＢＳ洗涤２次后分别加第一抗体，在３７‘Ｃ温育１ｈ。ＰＢＳ洗涤２次后，用二抗
（兔抗小鼠ＩｇＧＦＩＴＣ标志物）在室温下避光温育３０＂－４５ｍｉｎ。ＰＢＳ洗涤２次后，用荧光显微镜观察。
在实体显微镜下无菌剥离出牛胎儿生殖嵴／腺或类似物，分离出ＰＧＣｓ，接种在饲养层上。在倒置
显微镜下观察，ＰＧＣｓ呈圆形或椭圆形，比周围的体细胞大，核大胞质少，所形成的类ＥＧ细胞集落具
有典型的ＥＳ细胞集落形态，隆起，边缘整齐，集落中细胞排列致密，看不出明显的细胞间隔。有的集
落边缘出现许多单个细胞，变得不整齐；有的集落中央出现发黑的若干团块，可能是ＰＧＣｓ细胞分化和
凋亡的表现（图１）。ＡＫＰ染色：牛ＰＧＣｓ细胞集落着黑色，呈阳性，饲养层细胞不着色，为阴性（图２）。
Ｏｃｔ一４：牛ＰＣＣｓ细胞进行免疫荧光检测呈阳性，出现绿色荧光（图３）。
图１ ＰＧＣｓ克隆形态（２００×） 图２ ＡＫＰ（２００×） 图３ Ｏｃｔ一４（２００×）
收集的２８例牛胎儿分成４个阶段，胎龄小于４５ｄ（体长小于３．０ｃｍ）的７例，全部出现ＰＧＣｓ集
落；４５～５５ｄ（３．ｏ～５．０ｃｍ）７例，全部出现ＰＧＣｓ细胞集落；５５～７０ｄ（５．ｏ～９．０ｃｍ）９例，有７例
出现ＰＧＣｓ细胞集落；大于７０ｄ的５例，有２例出现ＰＧＣｓ细胞集落。可见：胎龄在７０ｄ以内的牛胎儿
适合分离培养ＰＧＣｓ；胎龄过大（＞７０ｄ）较难分离或者说不适合做ＰＧＣｓ的分离，５例中只有２例出现
Ｔａｂ・ １ Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｆｅｔａｌａｇｅｓｏｎｔｈｅｃｌｏｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｂｕｆｆａｌｏｐｒｉｍｏｒｄｉａｌｃｅｌｌｓ
牛ＰＧＣｓ细胞集落形态与小鼠ＥＧ细胞相似，呈圆形或椭圆形，比周围的体细胞大，集落边缘整齐，
隆起，细胞间界限不清，折光性强（图１），与前人的描述基本一致，但形态学方面的鉴定只能起一个
ＡＫＰ染色通常作为ＥＳ及ＥＧ细胞鉴定的一种常用的染色方法。牛ＥＧ细胞ＡＫＰ染色不稳定，有
的学者认为牛ＥＧ细胞ＡＫＰ染色呈阳性，有的学者则认为ＡＫＰ染色呈阴性。至于不同的学者报道牛ＥＳ
细胞的ＡＫＰ表达的差异，可能与不同的材料来源和牛ＥＳ细胞分化程度和表型有关，更可能与实验室
的具体情况和实验者的具体操作（染色程序）有关。在本实验条件下对原代的牛ＰＧＣｓ细胞进行染色，
发现ＡＫＰ染色呈阳性（图２），但ＡＫＰ活性能否作为牛多能干细胞的特异标记还有待于进一步研究。
Ｏｃｔ一４是维持细胞多能性的一个重要转录因子，是ＰＯＵ家族成员，缺乏Ｏｃｔ一４的胚胎在附植后不久死
亡，因为其ＩＣＭ不能正常发育，它在早期胚胎发育过程中起着重要的作用。同时，ＥＳ和ＥＧ细胞分化
的表达模式和基因剔除实验表明，Ｏｃｔ一４对维持ＥＳ和ＥＧ细胞未分化状态是必不可少的。Ｏｃｔ一４基因在
种系细胞和未分化的干细胞中表达，当分化时表达中止，本实验对原代牛ＰＧＣｓ细胞进行免疫荧光检测
呈阳性，出现绿色荧光（图３），可初步确定本实验分离培养的ＰＧＣｓ细胞具有多能性。
在家畜和人ＥＧ细胞分离克隆时胎龄的选择方面，不同种动物有所不同。猪取２４～２８ｄｐｃ胎儿生殖
嵴Ｌ１４０；牛取２９～３５ｄｐｃ胎儿生殖嵴（Ｃｈｅｒｎｙ等）Ｅ１５３或３０～５０ｄｐｃ牛胎儿生殖嵴ｎ６ｊ；兔取１５～１８ｄｐｃ胎
儿生殖嵴；山羊取２５ｄｐｃ龄胎儿生殖嵴［１６］；人取５～９ｗ胎儿生殖嵴［”］。徐小明等‘－ｓ３的研究中，１６例
ｄｐｃ的胎儿中有５例得到ＰＧＣｓ集落，１例传至３代。本试验收集２８例水牛胎儿ＰＧＣｓ分离培养
时，发现胎龄大小对牛ＥＧ细胞分离克隆影响很大，分离与培养水牛ＰＧＣｓ的胎龄不应超过９０ｄｐｃ（冠
臀长小于９．０ｃｍ）。胎儿太大，生殖嵴已转变为性腺，ＰＧＣｓ也大部分分化成生殖细胞，因而很难分离
到ＰＧＣｓ。本实验结果表明，胎龄在９０ｄｐｃ以下的胎儿均能分离到水牛ＰＧＣｓ细胞，但胎龄在５５ｄｐｃ以
胎儿的集落形成率明显高于５５ ｄｐｃ以上的水牛胎儿，可以推断出胎龄在２９～５５ ｄｐｃ（体长约为
１．ｏ～５．０ｃｍ）的水牛胎儿比较适合水牛ＰＧＣｓ细胞的分离与培养，胎龄在５５ｄｐｃ以上的水牛胎）ＬＰＧＣｓ
克隆形成率明显下降，但仍然可以用于水牛ＰＧＣｓ细胞的分离与培养，胎龄大于９０ｄｐｃ（体长大于９．０
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ｆｒｏｍｇｏａｔ，ｒａｂｂｉｔａｎｄｒａｔｓ口］．Ａｓｉａｎ—ＡｕｓＡｎｉｍＳｃｉ，２０００，５８７—５９４．
ＳＨＡＭＢＬＯＴＴＭＪ，ＡＸＥＬＭＡＮＪ，ＧＥＡＲＨＡＲＴＪＤ．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｆｒｏｍｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎ
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